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NCBI的BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）是一种广泛用于序列比对的工具，可以帮助用户将目标序列与数据库中的序列进行比对，找到相似或者一致的序列。通过序列比对，还可以进一步研究该序列是否有已知的蛋白质序列和结构信息，了解其行使的功能，也能对相似序列进行系统发生树（phylogenetic tree）的构建。

此前，已经为大家介绍过BLAST的下载及使用教程，序列相似性搜索必备神器——BLAST，下载及使用教程！也答应过大家，有机会会围绕具体使用场景对BLAST进行向此的操作介绍说明

今天主要为大家带来BLAST的保姆级操作教程，包含操作步骤、结果解读、结果导出三部分内容！

一、访问NCBI BLAST

打开NCBI BLAST官网：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

根据序列类型选择对应的BLAST程序：

• blastn：核苷酸序列比对核苷酸数据库（DNA vs DNA）。
• blastp：蛋白质序列比对蛋白质数据库（Protein vs Protein）。
• blastx：核苷酸序列（翻译为蛋白质）比对蛋白质数据库。
• tblastn：蛋白质序列比对核苷酸数据库（翻译为蛋白质）。
• tblastx：核苷酸序列（翻译为蛋白质）比对核苷酸数据库（翻译为蛋白质）。

此处选择的是 “Nucleotide BLAST”,即blastn比对。跳转到新的页面，如下

二、操作步骤

1.输入查询序列

可以直接输入序列或者序列访问号（ncbi核酸序列编号）在输入框中粘贴FASTA格式的序列（例如：>SequenceName后换行输入序列）。此处以PDCD1为例。

右侧的 “Query subrange”可以更具输入的序列选择子序列范围，一般不作操作。也可以点击“选择文件”按钮上传包含序列的文本文件。“Job Title”可以自命名运行的任务名称

2.选择数据库

进行比对的数据库默认情况下是选择标准的数据库，通过下拉选择需要选择比对数据集。

• nr
  ：非冗余蛋白质数据库（blastp常用）。
• refseq_rna
  ：参考RNA序列数据库（blastn常用）。
• Others
  ：如16S rRNA、基因组数据库等。

如果你清楚比对序列的物种，可以在“Organism”中选择相应的物种，使比对结果更精确。

3.比对程序选择

部分参数说明

● Expect threshold (E值)：默认值10，值越小比对越严格（推荐根据需求调整）。

● Word size：匹配的短序列长度（默认值因程序而异，如blastn默认为28）。

● Max target sequences：显示的最大结果数（默认100）。

● Filter：屏蔽低复杂度区域。

● Mask：Mask for lookup table only。

4.提交任务并等待结果

在选择好基本的参数后，就可以点击“BLAST”进行序列比对。等待结果生成（时间取决于数据库大小和服务器负载，通常几秒到几分钟）。

三、结果解读

1.序列信息页

2.比对结果关键指标说明

• scientific name：是这条相似序列所在的物种。
• query cover：是指我搜索的序列与这条序列的匹配程度（覆盖度）、E值是反应序列比对的可信度，E值越小，可信度越高。
• Total Score：比对得分，越高越好。
• E-value：期望值，越小表示匹配越显著（通常E<0.05认为有意义）。
• Per.ident：是序列比对的一致度。
• Accession：是这条相似序列在数据库的编号（登录号），直接着NCBI上用这个编号搜索就能找到这条序列的注释信息。

（2）graphic summary：用图的形式表现出与相似序列的比对结果

● 彩色条形图显示比对区域，颜色代表匹配相似度（红色最高，蓝色最低）。

（3） alignment：序列比对的结果/情况。包括一致度、相似度、序列长度等

● 查看具体比对区域，匹配的碱基或氨基酸用竖线|标出。

● 查询序列（Query）与数据库序列（Sbjct）的比对细节。

（4）taxonomy：是看这些相似序列在物种上的分类

四、结果导出

1. 下载结果

● 点击“Select columns”，选择需要的列进行下载。

• 点击“Download”按钮，选择需要的下载格式。

参考：

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/doc/blast-help/

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/doc/blast-quick-start-guide/chooseblastprogram.html

https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/factsheets/HowTo_BLASTGuide.pdf